嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)修饰的T细胞治疗在治疗血液肿瘤领域取得令人欣喜的治疗效果，尤其是抗CD19 CART细胞在治疗B细胞恶性肿瘤患者时显著提高了其临床结局。抗CD19和抗CD20 CART在治疗复发难治性B细胞急性淋巴细胞白血病B-ALL和非霍奇金淋巴瘤NHL的临床试验中已广泛开展，并显示出了一定的有效性。然而，CART治疗过程中，患者也出现了一些不良反应，如细胞因子释放综合征CRS，对于靶脱瘤毒性、神经毒性和肿瘤溶解综合征TLS，需要谨慎处理。随着CART治疗患者的增加，一些潜在的毒性也逐渐显现。

       在一个临床研究(NCT01864889)中，发现1例复发难治CD19+弥漫大B淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)患者接受CD19 CART治疗后，体内T细胞过度活化和增殖。输注后13天，外周血中淋巴细胞数达到77×109/L，CD8+活化T细胞占淋巴细胞的比例达到93.06%。患者出现了发热和缺氧，血清中细胞因子、乳酸脱氢酶、天门冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、谷草转氨酶等水平显著升高。基于临床数据和实验室数据，排除了T细胞白血病，未发现过度T细胞增殖是CD19抗原依赖的。

       通过对该患者T细胞受体TCR的高通量测序和全基因组测序发现，TCR具有多样性，但并没有与T细胞增殖有关的特异的基因突变。另外，该患者有JC病毒(John Cunningham polyomavirus，JCV)感染。因为病毒诱导的非特异型号可以调节细胞周期，不能排除JC病毒感染通过旁路途径对免疫系统的激活，导致T细胞过度活化和增殖。在进行CART治疗时应事先考虑细胞输注后在体内不受控制地活化和增殖的风险，提前制定相应的风险控制措施，对该患者的分析将有助于同类产品临床试验安全性风险的控制。

       案例信息

       这是一名29岁的亚洲男性，接受CART治疗前7个月被诊断为CD19+DLBCL IIIB期，接受了6个周期的治疗，包括2个周期的R-CHOP，2个周期的R-EPOCH，1个周期的R-GDP，以及1个周期的Hyper-CVAD，均未获得完全缓解。纳入CART临床试验前，进行了FDG-PET/CT扫描，显示右腋下病灶的淋巴瘤进展。最大病灶约为4×5 cm，SUVmax是23，其他身体区域未发现病灶。白细胞计数正常，WBC 5.58×109/L，淋巴细胞20.1%，中性粒细胞72.4%，骨髓未受累。采集该患者的外周血单核细胞PBMC，进行CD19 CART的生产。CD19 CART的激活域是CD3ζ，共刺激域是CD137(41BB)，采用慢病毒载体。在环磷酰胺(30 mg/kg，共3天)和氟达拉滨(25 mg/m2，共3天)预处理后，患者分3天接受了CD19CART(总剂量为2.53×106个/kg)。转染效率是74.5%。

       输注后患者较为耐受，未立即出现毒性。但在输注后第8天，外周血中CD19+B细胞显著下降，伴随着CAR拷贝数显著升高。输注后1周，B超检测发现，病灶减小至1 cm。输注后3周CT扫描与基线相比，病灶几乎消失。

毒性

       CART细胞输注后7天出现不良事件，包括发热(39.3℃)、寒战、皮疹。血清中一些细胞因子和C反应蛋白CRP水平迅速升高，包括颗粒酶A、颗粒酶B、IL-6、IL-10、TNF-α、IL-12p70、IFN-γ、IFN-β。实验室生化检测结果显示，输注后第9天，乳酸脱氢酶LDH和AST水平显著升高。ALT和γ-GT的峰值出现在第14天，考虑该患者发生了CRS，因此，给予了妥珠单抗(8 mg/kg，用药1天)和甲强龙(2 mg/kg，用药3天)。第11天，患者体温恢复正常，患者的转氨酶水平逐渐下降，CRS得到控制。第18天，患者体温低2次达到峰值，IL-6、IFN-γ、CRP水平升高，再次给予妥珠单抗(8 mg/kg，用药1天)。

       然而，出人意料的是，第13天，淋巴细胞计数迅速升高到77×109/L。流式细胞仪结果显示93.06%的淋巴细胞是CD3+和CD8+T细胞，CD8+CD28+T细胞占淋巴细胞比例从18%升高到90%，CD4+T细胞比例下降到非常低的水平，NK细胞(CD16+CD56+)几乎消失。分泌IFN-γ和颗粒酶的CD3+CD8+IFN-γ+和CD3+CD8+GrB+ 细胞高于基线水平。第17天，患者血氧过低，第18天，患者出现弥漫性肺渗出。皮疹的病理结果显示真皮层有T细胞，为避免白细胞淤积，第13和14天给予患者小剂量环磷酰胺(10 mg/kg)进行治疗，随后，白细胞计数逐渐下降。第34天，淋巴细胞计数又开始升高，因此又给予环磷酰胺(10 mg/kg，2天)，环磷酰胺剂量较小，不会诱导粒细胞缺乏。输注后第12天，患者的中性粒计数几乎为0，意味着患者粒缺将近20天。由于淋巴细胞迅速增殖，对粒细胞增殖造成抑制。第38天，由于患者出现寒战和高热，进行了血培养检测。培养3天后，发现了亚胺培南抵抗的不动杆菌属的鲍曼不动杆菌，虽然使用了多种抗生素的联合治疗，患者最终由于败血性休克死亡。

       输注后1天，对外周血和单核细胞的形态学分析结果初步显示，大量的未成熟淋巴细胞，90%是有核细胞。流式细胞仪分析结果显示，T细胞受体并非单一克隆，而是多样的。为确认TCR的多样性，进行了深度测序，结果显示样本中含有11030个不同克隆，另外，13个克隆比例占到1%以上，然而，无优势克隆或T细胞克隆，核型分析也未发现T细胞急性淋巴细胞白血病，因此，T-ALL引起的T细胞过度增殖可以被排除。

       为进一步分析T细胞过度增殖的原因，进行了二代深度测序，结果也未发现T细胞增殖相关的突变。通过实时定量PCR检测，发现有病毒DNA，且是JC病毒阳性。该病毒在免疫功能不全的人体内会再激活，引起严重致命的反应。

讨论

       T细胞存活受到T细胞受体TCR、共刺激分子(包括CD28)、黏附分子、细胞因子(如IL-2、IL-13、IL-15)、其他凋亡因子、抗凋亡因子的影响。在CAR+T细胞中，细胞的激活和增殖是特异抗原依赖的。在本文案例中，细胞输注后4天，CD19+B细胞水平仍然较低。由于淋巴结病灶消失，无法进行活检，也无从获知淋巴结是否表达CD19，不能排除病灶中CD19抗原诱导的T细胞增殖，然而，这种可能性很小。

       载体DNA整合到宿主细胞引起插入突变的风险较低，但是一旦发生十分危险。有文献报道，在两名年轻患者基因治疗后3年，LMO2位点的插入突变引起T细胞不受控制的增殖，CD3+T细胞达到100×109/L。然而，本案例的一系列流式细胞仪结果、测序结果和核型分析结果排除了这一可能。

       有报道称，在病毒感染存在时，非特异和抗原特异刺激均能引起CD8+T细胞增殖。本案例中，检测到JC病毒的存在。通过测序结果显示，患者中CD8+T细胞不是JC病毒特异的。排除了病毒相关抗原引起的T细胞增殖。但病毒感染引起的旁路激活途径不能忽视，T细胞可以被旁路激活途径刺激增殖，例如病毒感染产生大量细胞因子产生和释放，引起炎性微环境。体外实验证明许多细胞因子可以刺激CD8+T细胞增殖，如TNF-α、IL-2、IFN-α/β、IL-12、IL-15、IL-18。该患者发生CRS时，许多细胞因子急剧升高，然而目前还没有发生CRS的患者引起T细胞增殖的报道。

       由于CART治疗血液肿瘤疗效显著，多家医院正在开展或将要开展该疗法。除大家熟知的CRS、神经毒性等CART治疗相关不良事件外，T细胞过度活化和增殖对患者的生命造成很大威胁。在使用该疗法时应充分评估其安全性，做好相应的风险控制方案。

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