前言

       丙肝是一种由丙型肝炎病毒（HCV）感染引起的病毒性肝炎，主要经血液传播，如不洁针头、输血、穿刺等，仅在美国就有400万感染群体，在中国约有1000万患者，而在全世界患有丙肝的人数大约有1.8亿人之多。丙肝潜伏期长，早期症状不明显，如果不及时控制感染情况，会引起肝细胞的纤维化，并逐步导致肝硬化，进而发展成为肝癌。对于丙肝的治疗，早期主要以干扰素和利巴韦林配合用药，但副作用较大，后来陆续不断有新的化合物问世，如特拉匹韦（Telaprevir）、索非布韦（Sofosbuvir）等，而处于临床研究阶段的有Radalbuvir等。由于HCV的基因型有六种之多，亚基因型就更多了。另外，长时间服用单一的抗病毒 药物容易引起耐药性，因此和HCV的斗争将是长期的。

       Beclabuvir（BMS-791325）是Bristol-Myers Squibb开发的一种非核苷类NS5B RNA聚合酶抑制剂，目前还处于临床研究阶段（Phase III）。与其他含环丙烷结构药物不同的是，Beclabuvir的并环手性环丙烷结构对工艺放大提出了较高的要求。由于环丙烷结构具有较大的环张力，因此在药物结构中能够对分子的构象自由度产生较大的影响，在进行先导物优化时，嵌入环丙烷结构可能会取得意想不到的效果，本文分别以“药物化学路线”和“工艺放大路线”介绍此Beclabuvir的制备方法，以供参考。

       药物化学路线

       援引Boehringer-Ingelheim类似化合物的专利，以6-吲哚甲酸为起始原料，在碱性条件下，吲哚3位与环己酮发生亲核加成-消除反应，然后在50 psi的氢压下还原共轭双键、甲酯化，得到6-吲哚甲酸酯类化合物3，将3溴化后水解，以5步操作，56%的总收率得到羧酸4，BMS早期的专利以化合物4为起始原料，与N,N-二甲基磺酰胺缩合后再与硼酸6偶联，得到醛7。

       在得到醛7后，将其与磷酸酯8在CsCO3作用下发生Michael addition-HWE烯化串联反应（其具体历程如图四所示），得到不饱和酯9，9在经典的Corey-Chaykovsky条件下反应得到消旋环丙烷化产物10，将10手性拆分，得到的光学纯产物11后，水解成酸与12缩合，得到目标产物13。

       上述的药物化学路线呈线性策略，以中间体4计，共需7步，总收率约14%，基本能够满足早期的活性测试、毒理、动物试验，但由于磷酸酯8不稳定，容易发生聚合反应，且手性拆分在整个路线的后续阶段，造成较大的浪费，因此，为满足后续开展的临床试验，需要一条更加可靠而且能够放大的路线。

       工艺路线

       依据汇聚式的合成策略，将化合物13拆解为三个单一模块：14、12、15，首先14与15经N-烷基化反应组合，然后分子内偶联反应得到八元并环体系，最后与12缩合得到目标产物13，此设计的优势在于：第一、单独制备手性环丙烷模块15，避免了在路线后阶段手性拆分的巨大浪费（理论上只有50%的收率）；第二，将12的组装放在了路线的最后阶段，因为化合物12价格高昂，试剂级别的可以卖到5000 ￥/g；第三，单个模块制备的优化，不会影响整条工艺路线，尤其是中间体15。整个设计中，难度较大的在于手性环丙烷模块的制备，BMS的工艺化学家采用了不对称的金属催化卡宾环丙烷化反应。

       中间体14的制备

       药物化学路线中，化合物3的制备需要三步反应，而且还要用到贵金属催化剂，采用还原烷基化反应后，大大提高了反应的效率，以两步72%的收率得到中间体3，在放大到100kg级别时，收率和产物质量仍能保持，两步操作均只需要简单的后处理即可达到理想纯度。值得注意的是，NaOH水解时，碱的浓度过大会导致酯交换产物的出现。将3与N,N-二甲基磺酰胺在先前的缩合条件下反应时，发现生成了较多的杂质18，由于没有溴取代的存在，吲哚氮的亲核性较强，与磺酰胺竞争性的进攻酰基咪唑活性中间体，产生杂质18。

       在尝试更换溶剂以及调整加料顺序，仍不能改善反应状况后，用Boc将吲哚暂时保护，以DBU做碱，完成磺酰胺的制备后，再脱除保护基。通常情况下，Boc保护采用酸性条件脱除，但是在该路线中，由于未反应的CDI在酸性条件下快速分解，释放出大量的CO2气体，容易引发安全事故，因此将中间体4c在碱性条件下加热，在脱除Boc保护的同时，过量的CDI发生缓慢可控的分解，待反应完全后，加入盐酸中和，可以76%的收率得到目标产物14。重复四个批次，总计得到254 Kg的产物，产品质量和收率均能保持稳定。

       手性环丙烷15的制备

       手性环丙烷模块15可以简化为前体化合物19，令人惊喜的是，化合物19表现出良好的结晶性，而且与（R）-1-苯乙胺（（R）-AMBA）形成的盐20也能很好的结晶，这一性质不仅可以用于手性拆分制备模块15，也可以在不对称合成中提高产物的ee值。在得到盐20后，将其溶解在乙醇中，利用TMSCl原位生成HCl，很顺利的发生酯化反应。在进行羟基的甲苯磺酰化时，优选DABCO，其不仅能起到碱的作用，同时也能催化该反应的进行，一般在进行磺酰化反应时，常用吡啶做碱或溶剂，其他有机碱则经常会遇到反应不完或反应很慢的现象，考虑到吡啶的挥发性以及毒性，采用DABCO是很好的一个选择。至此，关键的步骤就在于手性化合物19的制备。

       1996年，Huw M. L.Davies在JACS上报道过一例关于不对称的金属催化环丙烷化反应，重氮化物在手性铑金属配合物的催化下，与烯烃发生不对称卡宾插入，得到手性环丙烷产物。受此启发，烯烃22与23经此法反应得到化合物21，然后将双键切断成醛，再还原可得到目标化合物19a。众所周知，重氮化物的稳定性欠佳，在工艺过程中操作起来较为复杂，如何放大该过程则成为关键问题。

       将3-甲氧基苯甲醛在醋酸中溴化，然后过滤，所得滤饼用碳酸钠溶液多次洗涤，除去多余的醋酸，以85%的收率得到溴化产物25。经Wittig反应得到关键前体22，此步反应的后处理非常重要，因为残留的三苯基膦会严重的影响下一步不对称环丙烷化反应，即使是400 ppm的残留也会造成催化效率的降低，因此，当反应完全后，加入过碳酸钠和H2O2水溶液，将残余的三苯基膦氧化为三苯氧磷，然后将产物溶于正庚烷中，三苯氧磷结晶析出，并用碱性氧化铝过滤，蒸发掉部分溶剂后，可得到约25%质量浓度的化合物22正庚烷溶液。放大至公斤级别时，收率在55%-65%左右。

       重氮化物23的制备以26为原料，在乙腈中与4-ABSA反应，可以77%的收率得到重氮化物，水相后处理可清除掉DBU，同时4-ABSA产生的磺胺类物质结晶析出，通过简单的过滤即可除去，值得注意的是，乙腈的溶剂残留会影响到下一步催化剂的效率，需控制在0.5%以内。在进行关键的环丙烷化反应之前，对重氮化物的安全性和稳定性需要有充分的认识，因为此类化合物易分解产生N2，容易造成安全事故，但与其他重氮化物不同的是，23虽容易变质，但不会放出氮气，而是经电环化反应生成吡唑类产物27，在固体状态下，其起始变质温度为42 ℃，在溶液中，其稳定性和溶剂以及浓度密切相关，通过量热法分析可知，在小于10%质量浓度的正庚烷溶液中，其变质速率在3?5%之间，但电环化产物27不溶于正庚烷，在使用之前过滤即可保证重氮化物23的纯度。

       得到烯烃22和重氮化物23后（两者均为正庚烷溶液），以23为基准，在反应釜中加入1.1当量的22，然后室温下加入0.2 mol %的Rh2(S-DOSP)4，控制23在1 h内加完（过快加入会产生大量N2，易造成冲料事故），收率能够达到90%，该反应放大时产物ee值介于80.6%到83.2%之间，至此，完成了关键的不对称环丙烷化反应。

       最终的模块组装

       在完成关键的环丙烷化反应后，将反应液的溶剂置换为DCM，经过双键的臭氧化、臭氧化物还原等一系列的官能团转化后，得到羧酸锂化合物21a，用MTBE萃取碱性水相溶液，即可除去过量22以及21氧化还原过程所产生的杂质，再将水相用HCl调回酸性后，萃取即可得到纯化的环丙烷化产物，将化合物20用（R）-1-苯乙胺进行结晶，可将ee值由80%左右提高到99%以上，然后参照先前手性拆分时优化的路线（图八）顺利得到模块15。

       在进行吲哚氮的烷基化时，首先采用15的结晶体，但是差示扫描量热法分析显示15容易发生自催化的环丙烷开环反应，将15制备成4 L/kg的甲苯溶液，能够较好的避免这一现象。在烷基化反应时，发现碱的用量非常重要，即使稍过量的碱，也会造成环丙烷部分的差向异构化（28a），此外，少量的28a也会影响到产物的结晶，多次优化表明，吲哚模块宜稍微过量（1.1 equiv），碱的用量宜控制在1.9~1.95当量之间，在具体操作时，吲哚模块和碱宜首先加90%的用量，然后根据反应进行的情况补加额外的碱和吲哚14，可保证15反应完全，在300 g规模的小试中，能以99%的HPLC纯度和74%的收率能得到产物28。由于此操作较为复杂，放大至公斤级时，略去了补加这一操作，容忍部分15未反应以保障产物的质量以及结晶性。在中试时，该反应的重复性较差，分三个批次制备了181 Kg的28，产率分别为39%、51%以及61%，纯度能保持在92%以上，因此吲哚模块的烷基化部分，还需要进一步的优化才能达到商业化的要求。

       在进行28的吲哚芳基化反应时，先采用化合物29进行模型研究。在进行初步筛选后，以NMP为溶剂，掉溴产物30a较多，DMF和DMAc相对较好，此外，溶剂中水含量过高也会引起掉溴产物的增多。催化剂筛选显示Pd(dba)2 和 Pd(tfa)2也会产生较多的30a，而Pd(OAc)2效果较佳，仅5mol %的用量就能保证底物完全转化。对配体的筛选发现PCy3HBF4效果最佳，而卡宾类配体则会产生大量的化合物30b。小量反应时采用K2CO3做碱，在放大时发现了掉溴产物的出现，换用KOAc后则很好的避免了这一问题。经过模型研究后，探索出的最佳条件为：5 mol %的Pd(OAc)2，10 mol %的PCy3·HBF4，5当量的KOAc，反应完全后，除目标产物外，有部分酯基水解产物30c出现，但这并不影响，因为下一步就是酯水解。

       值得高兴的是，模型研究的最优条件能够很好的移植到底物28的分子内偶联反应中。将甲酯置换为乙酯后，水解稳定性得到提高，待反应完全后，将DMAc蒸发，加入柠檬酸溶液，MTBE萃取后加入KOH水溶液剧烈搅拌，水解完全后首先用MTBE萃取除去磷配体，然后柠檬酸中和后将产物用MTBE萃取出来，将溶剂置换为乙醇，加入KOEt溶液后，产物以钾盐合一分子乙醇的形式析出，结合的乙醇需要在超过50 oC的温度下才能除去但这会导致产物变色，因此不适宜。重复该过程得到9.14 Kg的目标产物，平均收率68.2%，主要杂质为掉溴产物28b，钯残留也较高（~110 ppm）。

       上述路线还存在诸多缺陷，首先反应时间较长，需要12-16 h；其次，高沸点的DMAc不便于后期的处理；再次，钯残留过高；最后操作冗长，不够简练。首先对关键的钯催化分子内偶联反应的碱进行了大量筛选，最后发现采用KHCO3能够大幅缩短反应时间，只需要4 h就能反应完全；将溶剂置换为DMAc/PhMe = 1:1的混合溶剂，偶联反应完全后，直接将水和固体的KOH加至冷却的反应液中，略去了柠檬酸中和的操作。待酯水解完全后过滤除去钯催化剂，同时未水解的杂质28a溶解在甲苯中也被带走，然后将水相用盐酸中和，MTBE萃取，大量的DMAc溶于水相被除去，避免了DMAc的蒸发操作；将MTBE置换为乙醇，在加入KOEt结晶之前，加入少量的DMAc能够促进结晶，与先前的操作相比，仅需一次结晶过程就能完成产物的全部析出，最终产物以钾盐合1/2DMAc的形式析出，同时也避免了残留乙醇的处理过程，收率也得到了提高，达到85%，钯残留小于100 ppm，操作流程也得以简化。

       在进行最终的酰胺化时，采用先前药物化学路线中的TBTU作为缩合试剂，但是产生较多的杂质，且反应液颜色很重，纯化操作复杂，而EDAC体系则表现非常好，在对反应溶剂的筛选中发现MeCN、DMF、THF均适用于此缩合反应，但MeCN是最为合适的选择，因为MeCN与31?K共沸蒸馏可有效去除原料中残留的乙醇以及水分。经优化后的操作流程如下：底物共沸蒸馏、加入12，然后在依次加入HOBt、EDAC、DIPEA，未观察到可能的杂质32a和32b的出现。由于产物BMS-791325具有一定的水溶性，而EDAC的副产物以及HOBt、DIPEA也均溶于水，后处理时稍有不慎就可能造成产物的大量损失，因此在萃取处理时，用醋酸将水相酸碱性调至终产物的等电点范围内（pH ～4.5?7.0，等电点是一个分子或者表面不带电荷时的pH值），能够有效的避免产物的损失。

       经上述处理后，有机相中仍然含有大量HOBt，通常HOBt可采用碱性水溶液除去，但如果采用此法，API损失较为严重，将传统的碱性水溶液调整为pH = 7的K2HPO4/KH2PO4缓冲溶液，将萃取溶剂由EtOAc调整为iPrOAc，可有效的除去HOBt，处理完后，将所得的有机相（MeCN/iPrOAc）用iPrOAc恒容蒸馏，MeCN残留可降至检测限以下，然后再次用EtOH恒容蒸馏，将iPrOAc置换为EtOH，最后加入盐酸乙醇和MTBE结晶，得到目标产物的盐酸盐结晶，经过上述工艺，分三个批次制备了68.9 Kg的BMS-791325盐酸盐，平均收率78.5%，HPLC纯度大于99.6%，且ee值在99%以上。此工艺的缺点在于，大约有16%的产物残留在母液中无法析出，因此还需要后续的优化。

       备注：恒容蒸发是工艺中常见的溶剂置换操作，将含有产物的有机相蒸发至产物即将析出的临界点，然后持续加入置换溶剂，保证加入量和蒸发量相等，即保持产物溶液的体积不变，此操作能够有效的除去限制溶剂的残余。

       总结

       本文简要介绍了Beclabuvir（BMS-791325）从药物化学路线到工艺生产路线的开发历程。工艺路线采用了高效的汇聚式合成策略，吲哚模块14经六步操作三次纯化，总收率达到53%。模块20的（R）-1-苯乙胺盐的制备经不对称环丙烷化反应及连续的官能团转化得到（七步反应，两次分离纯化），总收率26%。最后的组合（模块14、20以及12）经六步反应三次分离纯化，总收率32%，整个工艺路线最长线性步骤12步，以8.2%的最终总收率得到目标产物BMS-791325?HCl。

       利用重氮化物进行卡宾插入反应，是天然产物合成中非常高效的操作，但是由于其安全性以及稳定性的问题，限制了此类中间体在工业领域的应用。此工艺路线是Davis不对称环丙烷化的首次工业应用，其对重氮化物的操作非常值得借鉴！在整个工艺开发中，对化合物的安全性以及稳定性的仔细研究，如重氮化物23以及环丙烷产物15，是安全生产和工艺顺利开发的保障，最后对于后处理的细致研究，如缓冲溶液洗涤、恒容蒸馏等，也非常值得学习借鉴。